综述|循环肿瘤细胞：从生物学新见解到临床实践

Circulating tumor cells: from new biological insights to clinical practice

癌症患者高死亡率的主要原因是转移，即肿瘤细胞通过血流从原始部位迁移到身体的其他部位。最近的技术进步显着增强了我们对循环肿瘤细胞 （CTC） 血源性扩散机制的理解。DNA 甲基化是一个关键过程，调节基因表达和染色体稳定性，从而维持体内的动态平衡。整体低甲基化和基因座特异性高甲基化是 DNA 甲基化模式变化的例子，这些变化对致癌至关重要。

综述首先概述了导致 CTC 形成的各种过程，包括上皮-间充质转化 （EMT）、免疫监测和定植。然后深入分析了 CTC 中 DNA 甲基化的修饰如何影响 CTC 传播过程中的每个关键阶段。此外探讨了 CTC 中 DNA 甲基化变化对癌症患者的潜在临床意义。通过了解这些表观遗传修饰，我们可以深入了解转移过程，并确定用于早期检测、预后和靶向治疗的新生物标志物。本综述旨在弥合基础研究和临床应用之间的差距，强调 DNA 甲基化在癌症转移背景下的重要性，并为改善患者预后提供新途径。

循环肿瘤细胞 （CTC） 是液体活检的基本组成部分。CTC 的概念最初由 Ashworth 于 1969 年提出，可分为三类：上皮型、间充质型和混合表型细胞。虽然大多数 CTC 可以被宿主免疫系统消除，但一部分高度活跃和转移性的 CTC 可能会逃避免疫清除，最终导致微观癌症病灶的建立、肿瘤复发和转移。因此，CTC 被认为是个体致命转移性疾病的合理来源。

CTC转移的途径、位置

a. 肿瘤细胞从原发性或转移性肿瘤中自然脱落，并在血液中循环。

b. 作为肿瘤转移的“种子”，可能导致形成其他各种部位的转移病灶。

为了成功从原发性肿瘤组织中分离，CTC 必须克服几个障碍，包括：

1） 粘附：原发性肿瘤组织中的细胞外基质 （ECM） 和周围细胞都被癌细胞牢牢粘附，癌细胞通常具有高度粘性。CTC 必须克服这些粘附力才能分离并进入淋巴或血液系统。

2） 侵袭：癌细胞还必须能够侵入邻近组织才能到达淋巴管或血管。这需要细胞降解 ECM 和周围组织。

3） 剪切应力：一旦进入血液或淋巴系统，CTC 就会由于液体的运动而受到显着的剪切应力。这会对细胞造成机械损伤，还会引发细胞凋亡（细胞死亡）。

4） 免疫系统监测：免疫系统不断监测血液和淋巴系统是否有外来或异常细胞。CTC 必须避免被免疫系统检测到才能生存并可能形成继发性肿瘤。

总体而言，CTC 分离和传播的过程很复杂，涉及许多不同的因素。

分化的祖细胞或体细胞干细胞可能是具有肿瘤起始能力的癌症干细胞 （CSC） 的来源。CSC亚群可能是导致复发和转移的原因，CTC 研究的主要目标是识别和消除这种循环 CSC 群体。在识别和分离 CTC 中的 CSC 后，有可能更有效地对抗残留癌症。循环 CSC 的起源可以考虑用两种假设来阐明。一是癌性体细胞干细胞经 EMT 从主要肿瘤中排出进入循环，这些细胞被称为间充质 CSC。二是这些细胞可能是完全分化的癌细胞的结果，这些癌细胞经历了 EMT 途径以获得迁移特性。无论途径如何，最终结果是 CSC 的扩散，CSC 通过表现出间充质、上皮和干性特征组合的中间细胞向生态位方向移动。这可以解释在 CTC 内的肿瘤起始细胞中观察到的表面标志物和/或转录因子的多样性。CTC 的异质性，源自 CSC 中的 EMT 或分化的癌细胞，强调了选择识别重要标志物的挑战。

支持 CTC存活和早期转移的 EMT 相关机制

a. CTC通过上皮-间充质转化(EMT)相关机制释放到血液中，包括单个细胞或集体迁移、内渗以及被动过程，例如分离的肿瘤细胞或团块通过受损血管的分离。某些单个或成簇的 CTC能够在血液中存活并在次级器官中形成转移。这是由于它们具有在 EMT诱导的细胞中升高的特性，并有助于它们在血液中的存活和转移的建立。

b. Fas/FasL信号通路在肿瘤发生中起着至关重要的作用，其中癌细胞损伤会导致对细胞凋亡的抵抗并导致肿瘤进展和 CTC的产生，cEMT 进展受整合素和 TGF-B等信号通路的调节，这些通路可以协同诱导下游反应，促进 CTC存活和抗细胞凋亡特性。

CTC 簇生成的机制和潜在的 CTC 亚群在血液循环中存活

发生 EMT 的 CTC 会表达组织因子（TF），显著促进血小板活化。这些凝血依赖性机制启动了肿瘤细胞周围富含纤维蛋白/血小板的茧的形成，据信可以保护细胞免受剪切应力、失巢凋亡和免疫攻击。上述茧的形成对于 CTC 播种和早期建立至关重要。此外，已观察到中性粒细胞与肿瘤细胞和血小板发生物理相互作用，从而促进肿瘤细胞存活和增殖。此外，中性粒细胞有助于 CTC 粘附到血管壁上。中性粒细胞通过它们在中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 中捕获肿瘤细胞的能力——这些结构也促进凝血事件——有助于形成支持 CTC 存活的保护和锚定支架。这个过程有助于 CTC 在毛细血管中停滞和转移形成的早期阶段。上述凝血和中性粒细胞依赖性屏蔽机制可保护 CTC 免受免疫破坏。此外，CTC，尤其是那些接受 EMT 的 CTC，具有更强的逃避免疫监视的能力。促成这种情况的一种机制是免疫检查点蛋白（如 PD-L1）的表达，这可能会增强它们对细胞毒性免疫细胞的抵抗力。在可能的休眠期后，CTC 最终可以恢复生长并引发继发性肿瘤。

CTC与免疫系统监测

CTC 克服免疫系统监视的机制尚不完全清楚，但有几种可能的方式可以逃避免疫系统的检测。一种解释是 CTC 抑制或掩盖免疫细胞通常识别为异常或外来的表面抗原的表达。这会使 CTC对免疫系统的可见度降低，并使它们能够逃避检测。另一种可能性是 CTC 产生抑制或抑制免疫反应的因子，例如将免疫细胞募集到肿瘤微环境中但随后抑制其功能的细胞因子或趋化因子。例如，研究表明，CTC 可以产生细胞因子 TGF-β，它可以抑制 T 细胞和其他免疫细胞的活性。最后，CTC 可能能够通过模拟正常细胞或使用其他机制来避免被发现来逃避免疫监视。例如，一些 CTC 可能表达通常存在于健康细胞中的蛋白质或分子，导致免疫系统难以将它们与健康细胞区分开来。

外周血中 CTC 的免疫逃逸机制

该图描述了 CTC 用于规避免疫系统的各种机制以及 CTC 与外周血中免疫细胞之间发生的相互作用。循环肿瘤细胞 （CTC） 和自然杀伤 （NK） 细胞之间的相互作用是一个突出的研究领域，因为 CTC 分泌 LDH5 并通过 ADAM10 脱落 MICA/MICB 配体，从而抑制通过 NK 细胞介导的裂解识别和消除 CTC。该图描绘了 CTC 采用的三种机制，以逃避 NK 细胞和 T 细胞通过 MHC I 分子的识别。这些策略包括通过与细胞表面结合的细胞角蛋白（CK8、CD18 和 CK19）掩盖 TCR 对 MHC I 的识别，通过膜从血小板转移到 CTC 获得“伪正常”表型，以及减少或完全消除 MHC I 表达。CTC 与自然杀伤 （NK） 细胞之间的相互作用是一个重点领域，因为 ADAM10 从 CTC 中释放 LDH5 和 MICA/MICB 配体会阻止它们通过 NK 细胞介导的裂解进行识别和消除。此外，LDH5 增强循环单核细胞上的 NKG2D 配体表达，进而降低 NK 细胞上的 NKG2D 表达。此外，该图说明了 CTC 用于逃避免疫系统的其他策略，例如抑制性免疫检查点分子 PD-L1 的上调、“别吃我”信号受体 CD47 的表达，以及凋亡蛋白 FAS 和/或 FASL 的表达改变。

表观遗传修饰在破译 CTC 特性中的作用

表观遗传学涉及对基因表达的可遗传改变的研究，这些改变发生在不对 DNA 序列本身进行修饰的情况下。许多表观遗传修饰，包括组蛋白乙酰化和甲基化模式、microRNA 介导的基因调控、癌基因的低甲基化、肿瘤抑制基因的高甲基化等，极大地促进了癌症的进展。

DNA 甲基化是甲基添加到 DNA 的胞嘧啶残基上，对于调节基因表达至关重要。偏离正常或预期模式的 DNA 甲基化模式与各种健康状况有关，包括癌症。几项研究表明，与原发性肿瘤相比，CTC 具有不同的 DNA 甲基化谱，这可能有助于检测早期癌症、预测癌症预后和开发靶向治疗。CTC 表现出与原发性肿瘤不同的独特 DNA 甲基化模式。此外，CTC 的 DNA 甲基化模式也会受到治疗的影响。 CTC 的基因甲基化景观以及这些甲基化变化如何导致 CTC 介导的转移还需要进一步的研究来揭示。此类研究可以揭示与转移相关的肿瘤特异性表观遗传特征和肿瘤种群的异质性。

跨癌症类型 CTC 中不同基因的异常甲基化

在 CTC 中起作用的不同 DNA 甲基化修饰以促进转移

甲基化促进 CTC 分离和侵袭的过程是复杂的，涉及各种基因的高甲基化和低甲基化。上图描述了不同类型甲基化改变对CTC转移潜力的影响

a. 肿瘤抑制基因 （TSG） 和转移相关基因 （MSG） 的高甲基化触发了 CTC 的分离，并有助于增强其增殖能力。与单个 CTC 相比，CTC 簇表现出不同的 DNA 甲基化谱，其特点是 OCT4、NANOG、SOX2 和 SIN3A。

b. 等转录因子的结合位点低甲基化，这些转录因子是与干性相关的转录因子，在诱导多能干细胞 （iPSC） 的多能性网络中起着至关重要的作用。

CTC 相关免疫中的 DNA 甲基化调节

DNA 甲基化在适应性免疫应答中起关键作用，包括树突状细胞发育和 T 细胞启动和激活。

a 最近的研究揭示了染色质重塑对肿瘤细胞中细胞毒性攻击的反应和肿瘤浸润 CD8 T 细胞中耗竭表型的贡献。

b CTLA-4 DNA 高甲基化与治疗反应不佳显著相关，突出了 CTLA-4 甲基化作为治疗结果预测生物标志物的潜力。

c 在肿瘤细胞中，DNA 修饰会影响肿瘤抗原的产生、抗肿瘤细胞因子的沉默和 PD-L1 检查点的诱导。

d 在 NK 细胞中，杀伤性 Ig 样受体 （KIR） CpG 岛的甲基化状态对于维持克隆性 KIR 表达和调节 NK 细胞识别和异常细胞裂解至关重要。

CTC甲基化模式的诊断及预后价值

对 CTC 中 DNA 甲基化模式的研究跨越多种癌症类型，为它们作为诊断、预后和治疗靶向的生物标志物的潜力提供了见解。Madhavan 等人在研究 CTCDNA 作为转移性乳腺癌预后诊断的潜力时，强调了循环游离 DNA 中甲基化模式作为肿瘤进展和治疗反应标志物的重要性。Powrózek 等人检查了 NSCLC 患者 CTC 中的 SHOX2 基因甲基化，发现 SHOX2 甲基化可以作为 NSCLC 预后和诊断的无创生物标志物。这表明 CTC 中的甲基化分析可能用于临床目的。已在癌症患者的 CTC 中检测到异常的 DNA 甲基化谱，这些模式已显示出作为诊断或预后生物标志物的前景。例如，Wong 等人的研究检查了肺癌患者 CTC 的 DNA 甲基化模式，发现患者生存率与特定基因的甲基化水平之间存在相关性，HOXA9 和 LMX1A 基因的高甲基化水平与较差的总生存期相关，而 IGFBP3 基因的高甲基化水平与较好的总生存期相关。Wu 等人的另一项研究调查了肺腺癌患者 CTC 的 DNA 甲基化模式，并确定了与转移相关的差异甲基化基因，GABRB2、CLDN3 和 SFRP1 的甲基化水平在有转移和无转移患者的 CTC 之间存在显著差异。

CTC 的 DNA 甲基化在肺癌中的应用

CTC 临床应用研究进展

目前根除转移的方法与用于原发性肿瘤的方法相同：专注于增殖和肿瘤发生，而不是直接解决转移级联反应。如果已经发生播散，则原发性肿瘤的手术干预或全身治疗并不总是能根除转移源。大多数抗癌药物在转移情况下进行初步评估，然后重新用于辅助治疗以阻止转移扩散。专门针对转移的药物的稀缺性，是许多临床前研究和对未来临床试验框架正面临的挑战。从理论上讲，针对转移过程中不同点的 CTC 的疗法可以阻止转移性癌症的进展，因为 CTC 是转移性癌症的原因，并且可能来自肿瘤内的不同亚群。

CTC 存在于所有主要癌症类型的外周血中，其对结直肠、乳腺癌、前列腺以及小细胞和非小细胞肺恶性肿瘤预后的意义已得到验证。当患者首次被诊断出患有转移性乳腺癌时，开始治疗前较高的 CTC 计数是较短的无病生存期和总生存期的预测指标。对于结直肠癌和前列腺癌患者，治疗前 CTC 计数与临床预后之间也有研究报道其负相关关系。许多研究表明，与基线 CTC 水平相比，治疗后 CTC 计数的波动提供了更可靠的预后见解。治疗后 CTC 的持续存在与较差的预测相关。在接受治疗的患者中，除了单次 CTC 计数外，CTC 簇丰度的评估还显着提高了预后价值。

CTC 计数可在疾病临床表现前 7-9 周检测到。这表明患者的 CTC 分析可有助于预测微小残留病和后期复发的可能性，并可作为早期癌症诊断的工具。由于无创、高度可重复性和敏感性，循环肿瘤 DNA 甲基化的检测已成为治疗后动态监测肿瘤反应的关键方法。通过动态监测循环肿瘤 DNA 甲基化，可以进行早期肿瘤复发检测，这有助于临床决策。

靶向CTC 甲基化肿瘤治疗研究进展

循环肿瘤 DNA 提供的肿瘤信息有助于指导后续的靶向治疗选择。目前的研究主要集中在循环肿瘤 DNA 中的突变信息，详细的基因突变分析可以阐明癌症分子图谱，从而有可能带来更合适的治疗方案。而关于使用循环肿瘤 DNA 甲基化进行治疗靶点选择的研究很少。这种差异是由于癌症患者循环肿瘤 DNA甲基化状态变化是肿瘤反应而不是肿瘤原因。

令人振奋的是，使用 DNA 甲基转移酶抑制剂时，胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌在内的癌症可能会受益于 DNA 甲基化靶向治疗。有研究展示了CTC 中的 DNA 甲基化模式具有治疗意义。例如，Chen 等人的一项研究表明，用一种叫做地西他滨的 DNA 去甲基化剂治疗，通过逆转肺癌患者细胞中异常的 DNA 甲基化模式，减少了这些细胞的 CTC 转移。CTC 的 DNA 甲基化谱已显示出在肺癌诊断、预后和治疗方面的巨大潜力。

总结

CTC 是从原发肿瘤分离并进入淋巴或循环系统的肿瘤细胞。这使得肿瘤细胞能够扩散到全身并导致新肿瘤的形成。患者血液中的 CTC 数量与疾病的进展和转移的机会相关，甚至在通过常规方法识别肿瘤之前，患者的血液中就已经发现了 CTC，这提供了证据表明它们可能是肿瘤早期识别和监测的宝贵工具。

DNA 甲基化是甲基添加到 DNA 的胞嘧啶残基上，是调节某些基因表达所必需的。许多癌症类型，包括肺癌，都与疾病发作和进展时的异常 DNA 甲基化模式有关。已经发现 DNA 甲基化在CTC 的免疫监视和转移中都起作用。免疫系统识别和清除癌细胞的方法称为免疫监视。然而，通过 DNA 甲基化，CTC 可以抑制免疫相关基因的表达，使它们能够逃避免疫系统并持续存在于血液中。例如，已发现一些 CTC 具有参与抗原加工和呈递的基因的 DNA 高甲基化，这可能有助于它们逃避免疫系统的识别和消除。此外，DNA 甲基化也参与 CTC 的转移。例如，EMT 过程对癌细胞侵袭和转移至关重要，它与参与细胞粘附和迁移的基因 Ecadherin的 DNA高甲基化有关。此外，已经发现 CTC 的转移潜力受 DNA 修复和细胞周期调控相关基因低甲基化的影响。

这篇综述概括了在癌症背景下围绕 CTC 生成的障碍，以及表观遗传学修饰对 CTC 在 EMT、免疫监视、集群形成和定植方面的影响。CTC 中 DNA 甲基化导致的表观遗传修饰可能是解开肺癌转移潜在机制的关键，并在肺癌诊断、预后和治疗领域具有重要前景。