RT-PCR技术可以从每毫升血液中检测到单个肿瘤细胞。Wang等在乳腺癌中利用以KRT19和ERBB2作为目的基因进行双相RT-PCR检测发现，双相RT—PCR检测循环肿瘤细胞的敏感性比免疫细胞化学技术检测要高，而且特别在早期乳腺癌尤为明显[12]。但是，由于mRNA的不稳定性、取样时上皮细胞的污染、肿瘤标志物在外周血的非正常表达以及假基因干扰等因素的影响，可致假阳性。同时该方法无法进行形态学观察以及肿瘤细胞的定量限制了该技术的应用。

2.3 流式细胞术（Flow cytometry，FCM）

是一项集激光、电子物理学、计算机、流体动力学、细胞免疫学等方法为一体的细胞分析技术。它利用肿瘤细胞单抗结合荧光物质使肿瘤细胞染色，然后用流式细胞仪分析，染色细胞被视为阳性，大致敏感性为1/105。此技术可以对外周血样本的CTCs进行精确定量技术，并可以检测细胞DNA含量。近来高通量FCM（如Fishman-R microfluidic FCM）以及新肿瘤标志物（如EGFR、磷酸化EGFR）的应用大大提高了流式细胞术的诊断效率[13]。

2.4 CTCs芯片技术（CTCs-Chip）

CTCs芯片系统富集得到的CTCs采用相同的分析方法，由于CTCs并不表达白细胞的共同抗原CD45，该检测系统采用不同荧光标记的抗EpCAM抗体、抗EGFR抗体、抗细胞角蛋白CK-8、CK-18和CK-19抗体以及核荧光染料DAPI作为阳性指标，CD45作为阴性指标。可在10亿以上血细胞检测出单个癌细胞，敏感性非常高，并适用于所有类型肿瘤患者的外周血样本。该方法大大提高了敏感性和从全血中捕获稀少细胞的得率, 同时操作过程简单温和，从而使分离到的CTCs保持活力。目前第二代CTCs-Chip技术（Hchipherrin one—chip），不仅改进了该芯片构造，使血液标本流经芯片时形成微漩涡，增加了芯片表面包被抗体捕获CTCs的机会，更加有效捕获数量极少的CTCs，可捕获血液中90%以上的癌细胞，而且该芯片还安装了一个标准载玻片，可使用传统病理检查方法鉴别癌细胞[14]。

3 循环肿瘤细胞检测的临床应用

循环肿瘤细胞在原发肿瘤早期就可以发生并可以在外周血中检测到，已经开始用于肿瘤的辅助诊断。近年来，CTC检测在临床上的应用使之成为了国际肿瘤分期系统的标准之一。2007年美国临床肿瘤协会（ASCO）首次将CTC纳入肿瘤检测标志物[15]。CTCs作为一种全新的肿瘤生物标志物，在疾病早期阶段有助于良、恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤早期诊断、辅助诊断与肿瘤分期、判断患者预后，治疗过程中可用以进行疗效监测以及指导个体化治疗。但必须认识到：自2004年美国强生公司Veridex开发的Cellsearch CTC检测技术获得美国FDA认证（准入应用于预测有转移性的乳腺癌、结直肠癌或前列腺癌的无进展存活率和总存活率）以来，其它众多厂家推出的循环肿瘤细胞检测仪器都未获得相关认证或准入，对恶性肿瘤的应用领域也未在更广的肿瘤类型中获得准入。目前，更多的报道尚处于临床研究阶段。但是，CellSearch CTC检测系统2015年底已告停产的传闻也从侧面反映了为“肿瘤患者的科学算命”中“算命”的份量更重一些。

乳腺癌是我国女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年上升，远处转移是主要的致死因素。CTCs的检测对乳腺癌预后判断、监测病情和早期发现微转移等具有重要临床意义。Biggers等检测了41例早期乳腺癌患者，其中10例（24.4%）在术前已可检测到CTCs。研究表明，转移性乳腺癌患者在治疗前、治疗中和治疗后的CTCs水平均与其预后密切相关，CTCs可作为转移性乳腺癌患者独立的预后因子。有研究报道采用黏蛋白1（mucin 1，MUC1）和CK19共同作为检测乳腺癌CTCs的标志物，用EPISPOT检测转移性乳腺癌（metastatic breast cancer，MBC）患者中CTCs分泌的MUC1，结果发现所有被检者的结果均为阳性，而健康人群中却无法检测得到。龚福生等的研究显示，62例乳腺癌患者CTCs的阳性率与TNM分期、Ki-67和HER-2表达与否显著相关，而与月经状态、ER和PR表达与否无关[16]。本研究在I期患者中有1例检出CTCs（16.7%），提示癌细胞扩散可以出现在早期患者中。因此，检测乳腺癌CTCs有助于及早确定复发、转移的高危患者，通过及时治疗干预，可以阻止肿瘤的复发转移。研究表明，转移性乳腺癌患者在治疗前、治疗中和治疗后的CTCs水平均与其预后密切相关，CTCs可作为转移性乳腺癌患者独立的预后因子。

临床上结直肠癌的