循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）是指在肿瘤形成和发展过程中，从实体肿瘤病变脱落并进入血流循环的肿瘤细胞。CTC是肿瘤发生发展的直接证据，真实反映了肿瘤负荷和特征，并可以提示疗效及预后。既往研究认为CTC的出现即提示肿瘤转移的发生，然而近期研究在早期肿瘤患者外周血中也发现了CTC的存在，因此CTC也可用于早期诊断。此外，与循环肿瘤DNA/RNA和肿瘤细胞来源外泌体相比，CTC还可进行RNA和蛋白组学的表达谱分析、体外细胞形态和功能研究以及信号共定位展示等，为个体化治疗提供了坚实基础。虽然CTC检测具有方便、快捷、无创和可重复采样等优势，但是外周血中CTC数量非常少（转移性乳腺癌中每106~108个有核细胞仅有1个CTC），通常需要富集之后再进行检测或分析。以往因受限于提取和富集技术，CTC并未得到进一步研究和应用。直至近十几年，基于CTC物理特性和分子生物学特征的分离、提取和富集技术的发展，CTC才被应用于临床，并获批为肿瘤标志物，在肿瘤的早期诊断及疗效和预后评估中凸显优势，现就CTC的发展历史、提取技术及临床应用研究进展进行阐述。

01CTC发展概况

1869年Thomas Ashworht首次报道了CTCs的存在。之后Stephen Paget等提出了“种子与土壤”假说，认为肿瘤转移的机制是癌细胞通过血液和淋巴扩散至身体不同地方，从而诱导周围正常细胞形成“肿瘤微环境”。1998年，CTC首次从血液中分离，并被证实与病理分期相关 。此后，CTC才被应用于临床。发表在N Engl J Med 的一项前瞻性研究结果提示CTC数目是预测转移性乳腺癌无进展生存期（progression-free survival，PFS）和总生存期（overall survival，OS）的独立预后因子。自此CTC被认为是肿瘤转移的“前兆”，即CTC是肿瘤转移病灶（血行转移）形成的“种子”细胞，部分细胞可在循环中存活，并在远端器官与新的微环境相互作用下形成转移灶。因此2007年，CTC被美国临床肿瘤学会（ASCO）纳为肿瘤标志物。然而，2010年发表在 J Clin Invest 的研究表明，肿瘤早期也发现CTC的存在。基于此，2012年病理学年鉴不再认为血液中发现CTC仅提示肿瘤转移的“前兆”。目前随着高通量测序技术和单细胞测序技术的出现，CTC全外显子测序和单细胞测序将有助于更进一步揭示肿瘤异质性和肿瘤演进过程。

02CTC分离、富集和检测技术

CTC的应用与分离技术发展密切相关。第一代CTC分离技术主要依靠CTC物理特征，如基于细胞大小和密度法是通过膜过滤、密度梯度离心等方法进行分离。这一类方法不依赖CTC抗原表达情况，操作方便，但因CTC变形性以及密度差异易导致漏检，影响分离效果。第二代分离技术是基于CTC表面抗原的表达，利用免疫磁珠进行分选。从本质上讲，这种方法可以分为两大类：基于特定抗原的表达捕获CTC细胞的阳性选择和耗尽给定样品中非CTC的所有细胞的阴性选择。目前唯一获得FDA批准的Cell Search系统就是利用表面抗原的表达进行CTC分选。但该方法受上皮标志物表达影响。到目前为止，仍未有公认和普适性的肿瘤表面抗原标志物，原因有以下几方面：⑴并非所有肿瘤细胞均表达上皮标志物，例如黑色素瘤并不表达上皮标志物。⑵肿瘤细胞入血时会发生上皮－间质转化（epithelial-mesenchymal translation，EMT），下调上皮标志物表达量，导致磁珠对CTC的吸附能力下降，影响检出率。⑶在正常情况下，有极少量的正常上皮细胞脱落入血，或者肿瘤患者在进行手术或其他创伤性治疗后，上皮细胞可进入血液，导致假阳性的出现。第三代分离技术是利用芯片，包括CTC芯片和微流控芯片等对CTC进行分离、富集。该技术并不是一种独立的分离技术，而是优化各类技术的一种手段。该技术分离原理多样，包括基于肿瘤细胞大小、流体力学特性、表面分子标记以及去除白细胞进行阴性富集等。第一代芯片以CTC-Chip为代表，包括Captura公司的GEDI-Chip和Biocept公司的OncoCEE微流微柱富集，主要是利用CTC与血细胞生化特性的差异，在芯片中设置微柱阵列将CTC从血液中分离出来。然而，微柱设计比较复杂，难以进行高通量生产。第二类芯片是以HB-Chip为代表，包括GEM-Chip、GO-Chip以及BioFluidica公司的Modular Sinusoidal Microsystem微流表面富集，此类芯片使用抗体包被捕获